Genotiparea mistrețului cu utilizarea dispozitivului Bento Lab

Abstract

Introducere. Mistrețul aparține genului Sus din familia Suidae și fiind strămoșul porcului domestic se poate încrucișa ușor cu acesta. Hibridizarea între mistreț și porcul domestic crește gradul de invazivitate și afectează integritatea genetică și potențialul de adaptare al mistreților. Deoarece astfel de hibrizi de cele mai multe ori nu pot fi identificați morfologic, există mai multe metode și tehnici moleculare pentru diferențierea acestora de liniile pure. O astfel de metodă este genotiparea pe baza alelelor genei MC1R. Alelismul multiplu al acestei gene poate fi observat fenotipic prin diversitatea pigmentării pielii la porci. În prezent, gradul de hibridizare a mistreților din fauna Republicii Moldova este necunoscut, motivul principal fiind lipsa protocoalelor experimentale de laborator care ar permite identificarea specimenilor hibrizi.

Scopul. În prezentul studiu ne-am propus utilizarea dispozitivului Bento Lab pentru genotiparea unor specimene de mistreț din Republica Moldova în baza alelelor genei MC1R.

Material și metode. Genotiparea a fost realizată prin digestia ampliconilor MC1R cu enzimele de restricție BspHI și BstUI (RFLP-PCR). Au fost prelevate 14 probe de la mistreț din diferite regiuni ale țării. ADN-ul genomic a fost extras conform protocolului GeneJET Genomic DNA Purification Kit, iar amplificarea s-a realizat  cu utilizarea primerilor MC1R-FW și MC1R-REV modificați și a mastermixului DreamTaq Green PCR Master Mix (2X). Ampliconii obținuți au fost supuși digestiei cu enzimele BspHI și BstUI, produșii de digestie fiind vizualizați pe gel de agaroză de 1 % cu agent de intercalare GelGreen. Etapele de extragere, de deamplificare și vizualizare a ADN-ului au fost realizate cu  dispozitivul Bento Lab. Acest  dispozitiv este portabil și combină cele mai importante echipamente necesare pentru realizarea unei reacții de PCR: microcentrifugă, termociclor, casetă pentru electroforeză, bloc de alimentare încorporat și transiluminator.

Rezultate. Analiza celor 14 probe a permis identificarea alelelor E⁺, e și a două genotipuri: E⁺E⁺ și E⁺e. E⁺ reprezintă alela sălbatică și la mistreții de linie pură se întâlnește în formă homozigotă, în timp ce alela e se întâlnește la unii porci domestici. Astfel, genotipul homozigot E⁺E⁺ a fost identificat în 13 probe, iar genotipul heterozigot E⁺e – într-o singură probă (specimen hibrid). Protocoalele de lucru au fost optimizate și adaptate la condițiile și la resursele laboratorului. Dispozitivul Bento Lab a permis extragerea calitativă a ADN-ului genomic, realizarea reacției de PCR convențional și vizualizarea ADN-ului pe gel de agaroză. Produșii de digestie au putut fi clar vizualizați și au format un tablou electroforetic specific fiecărui genotip.

Concluzii. Dispozitivul Bento Lab și protocoalele experimentale menționate au fost utilizate cu succes pentru aplicarea metodei RFLP-PCR și genotiparea mistreților, și a permis identificarea unui specimen hibrid din cele 14 probe testate. Studiile de genotipare a mistreților din Republica Moldova ar eficientiza prevenirea focarelor de boli infecțioase (ex. pesta porcină africană), determinarea gradului de hibridizare în populațiile de mistreți și elaborarea măsurilor adecvate de conservare.

Notă. Studiul a fost efectuat în cadrul proiectului 20.80009.7007.02. „Schimbări evolu-tive ale faunei terestre economic importante, ale speciilor rare și protejate în condi-țiile modificărilor antropice și clima-tice”, Program de Stat (2020-2023).